“唐和唐”L-阿拉伯糖/半胱氨酸Maillard反应动力学的研究

发布时间:2010-11-06   新闻来源:公司信息部   浏览次数:

 

L-阿拉伯糖/半胱氨酸Maillard反应动力学的研究
侯亚龙1,陈正行1,罗昌荣2,王光雨2
(1.江南大学 食品学院,江苏无锡 214036;2.华宝食用香精香料(上海)有限公司,上海 201821)
摘要:本文通过模型体系的建立,研究了L-阿拉伯糖/半胱氨酸Maillard反应动力学。利用高效液相色谱-蒸发光散射检测器,分析了Maillard反应产物,比较了不同反应条件下阿拉伯糖/半胱氨酸模型体系中L-阿拉伯糖的残留情况的反应动力学特征。研究表明,pH 5、120 ℃条件下,Maillard反应初期L-阿拉伯糖与氨基酸结合迅速,是一个动力学控制过程;随着反应时间的延长,反应速率趋于稳定,反应速率取决于Amadori化合物分解为产物的速率,是一个热力学控制过程。反应温度对Maillard反应速率的影响大于反应时间,高温可使Maillard反应速率迅速提高。初始pH对Maillard反应影响最大,酸性和弱酸性条件反应缓慢,中性和碱性条件下反应快速。pH5、反应温度120 ℃时,L-阿拉伯糖的残留率随反应时间的延长而下降,反应时间180 min时残留率为50.53%;pH5、反应时间1 h时,反应温度不同L-阿拉伯糖的残留率不同,在40~100 ℃范围内残留率变化(70.4%~76.78%)不大,在100~140 ℃范围内随反应温度的上升残留率迅速下降,140 ℃时残留率为27.79%;反应温度120 ℃、反应时间1 h时,酸性条件下不同初始pH,残留率变化不大。但中性及碱性条件下残留率迅速下降,pH 9时残留率为15.1%。结论:反应时间对L-阿拉伯糖的残留率影响远不如反应温度和pH,其中pH的影响最为显著。
关键词:阿拉伯糖/半胱氨酸Maillard反应模型体系;阿拉伯糖残留率;温度;pH;反应时间
中图分类号:Q 53   文献标识码:A   文章编号:1000-2324(2008)03-0339-06
收稿日期:2005-10-11
基金项目:上海市引进技术的吸收与创新项目(04-20-2)
作者简介:侯亚龙(1971-),女,四川人,博士研究生,研究方向为Maillard反应及其在香精中的应用。
KINETIC ANALYSIS OF L-ARABINOSE/CYSTEINE MAILLARD REACTION
HOU Ya-long1, CHEN Zheng-xing1, LUO Chang-rong2, WANG Guang-yu2
(1. School of Food Science and Engineering, Southern Yangtze University, Wuxi 214036, China;2. Huabao Food Flavors & Chemicals Fragrance (Shanghai) Co. Ltd,Shanghai 201821, China )
Abstract:The lossreactivity of L-arabinose in the Maillard reactionmodel system of containing arabinose/ and cysteine under different reaction conditions was analyzed and compared by method of high performance liquid chromatography(HPLC) associated with evaporative light-scattering detection (ELSD). In the initial stage of reaction of model system which was heated to 120 ℃ in an autoclave at pH5, Under the condition of pH5, 120℃ the percentage of residual L-arabinose decreased with the increasing reaction time prolonging and after 180min reaction the percentage of residual L-arabinose was 50.53%; at pH5 after 1h reaction the ratio of residual L-arabinose changed a little (between 70.4%-76.78%) at the range of 40-100 ℃, but decreased rapidly at 100-140 ℃, and the ratio of residual L-arabinose reached 27.79% at 140 ℃; when reacting at 120 ℃ after for 1h reaction, the effect of pH on the ratio of residue of arabinose was weak when the initial pH of the system is lower than 7, but the effect became strong when the initial pH≥7 and the ratio of residual arabinose was 15.1%. L-arabinose combined with amino acid rapidly, and it was kinetics-controlled course. With the reaction continuing, the reaction rate was stable and determined by the decomposition rate of Amadori compounds. It was a thermodynamics-controlled course. Results showed that the effect of reaction time on the ratio of residual arabinosereaction rate is was weaker than those of temperature and pH, and initial pH of reaction mixture is was the most important factor. Under acidic or weak acidic condition the reaction was slower than that under neutral or alkaline condition.
Key Words:Maillard reaction model system of Arabinose and /cysteine;L-arabinose;the percentage of residual arabinose;temperature;pH;reaction time
  许多研究表明,Maillard反应及其产物对食品、医药和人类健康产生着重大影响,越来越受到人们的关注[1,2,3,4]。阿拉伯糖是自然界中普遍存在的一种戊糖,可由半纤维素、树胶等多糖类物质水解得到。近年来研究发现阿拉伯糖的反应型香精能产生柔和、丰富的香气风味,目前不少国外香精公司在尝试使用L-阿拉伯糖生产反应型香精,如Danisco公司已有L-阿拉伯糖 CT98 和L-阿拉伯糖糖浆两种产品作为反应型香精的生产原料供应国际市场。但目前针对阿拉伯糖的Maillard反应机理的研究甚少。
  半胱氨酸是生产肉类香精必用的氨基酸,因此本文采用L-阿拉伯糖/半胱氨酸建立模型体系,研究L-阿拉伯糖/半胱氨酸反应动力学特性,为实际的香精生产提供一定的理论指导。
1 材料与方法
1.1 试剂和仪器
  
L-阿拉伯糖(标准品):纯度>99%,Sigma公司提供;L-阿拉伯糖(反应用):美国Sanland公司产品,纯度>99%。L-半胱氨酸:BR级,国药集团上海试剂有限公司;磷酸二氢钠、磷酸氢二钠:均为AR级,国药集团上海试剂有限公司。
  Agillent1100型高效液相色谱仪:美国Agillent公司;ELSD800型蒸发光散射检测器:美国Alltech公司;Vortex XW-80A型漩涡混和器:上海医科大学仪器厂;AL204型分析天平:瑞士METTLER TOLEDO公司;DELTA 320pH计:瑞士METTLER TOLEDO公司。
1.2 样品的制备
1.2.1 反应液的制备 
第一组,120 ℃条件下反应时间对L-阿拉伯糖Maillard反应动力学性质的影响。用pH5的0.2 mol/L磷酸盐缓冲溶液配制浓度均为0.2 mol/L的L-阿拉伯糖和L-半胱氨酸混合液,分别装入15支反应管,拧紧螺旋盖。在120±0.02 ℃油浴中分别反应20 min、40 min、60 min、120 min、180 min,重复3次。第二组,反应温度对L-阿拉伯糖Maillard反应动力学性质的影响。采用与第一组相同的混合液,分别在40 ℃、80 ℃、100 ℃、120 ℃和140 ℃下反应1 h,重复3次。第三组,初始pH对L-阿拉伯糖Maillard反应动力学性质的影响。取少量指定pH ( pH3、5、7、9)的0.2 M磷酸盐缓冲液将半胱氨酸和L-阿拉伯糖分开溶解,分装于2支试管中,并用6 M的NaOH或浓HCl小心调半胱氨酸溶液和L-阿拉伯糖溶液至指定pH。将二者混和装入容量瓶并用同样pH的缓冲溶液定容得到L-阿拉伯糖及L-半胱氨酸浓度均为0.2 M的混合溶液。每个pH的混合溶液120 ℃反应1 h,重复3次。
1.2.2 反应产物的处理 样品反应结束后,立即用冰水浴冷却至室温以下,适度稀释后加入适量活性炭粉,漩涡混和器混匀后4 ℃冰箱静置一定时间,取上清液微滤入2 mL进样瓶。
1.3 高效液相色谱-蒸发光散射检测器(HPLC-ELSD)联用
1.3.1 色谱条件 HPLC
Prevail Carbohydratio ES 5u(250×4.6mm)糖柱(美国Alltech公司),柱温:25 ℃,流动相:乙腈:水(70:30),流速:1.0mL/min,等度洗脱,进样量:10μL。
1.3.2 ELSD检测原理及检测条件 恒定流速的色谱仪洗脱液进入检测器后,被高压气流雾化形成的小液滴进入漂移管(蒸发室),流动相及低沸点的组分被蒸发,剩下高沸点组分的小液滴进入散射池,光束穿过散射池时被散射,散射光被光电管接收形成电信号,信号经放大转换成为数字信号-色谱图。漂移管温度:50 ℃,气体压力:3.0 bar。
1.3.3 数据处理 实验数据处理由AllChrom Plus Chromatography Data System进行。
1.4 L-阿拉伯糖标准曲线的制作
  
L-阿拉伯糖50 ℃真空干燥至恒重后,用双蒸水配制浓度为10.0 mg/mL的L-阿拉伯糖标准溶液。将标准液梯度稀释得浓度分别为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0和10.0 mg/mL的溶液,微滤后分别装入2 mL进样瓶进行检测。
1.5 糖残留率的计算
  L-阿拉伯糖残留量的计算:ELSD的检测结果经AllChrom Plus Chromatography Data System软件积分得到L-阿拉伯糖峰面积,由L-阿拉伯糖标准曲线计算得到所检测样品的浓度(外标法),再乘以检测前处理时的稀释倍数,得到实际反应结束时L-阿拉伯糖的残留量。
2 结果与讨论
2.1 分析方法的正确性
  ELSD的检测结果表明,糖的峰面积与糖浓度成对数线性关系:
logC=0.7736031logA-4.444409,R2=0.999415
  式中:C——L-阿拉伯糖浓度,mg/mL;
     A——ELSD检测得到的L-阿拉伯糖峰面积
  标准溶液对标准曲线的验证表明,3次检测结果的相对误差小于3.0%。
  对同一份经处理后的样品连续进样5次,结果见表1,RSD值为1.22%。标准溶液的连续3次测定结果见表2,与真值的相对误差<3%。这些结果表明,HPLC-ELSD测定方法具有良好的可靠性。
1 样品的精密度实验结果
Table 1 The result of precision test
样品编号
NO.
L-阿拉伯糖残留量(mg/mL) L-arabinose residue
n
平均值
Average
RSD(%)
3-3
8.22
8.30
8.35
8.45
8.20
5
8.30
1.22

2 准确度实验结果
Table 2 The result of accuracy test
标准液浓度(mg/mL)
Standard concentraiton
测量值(mg/mL) Value observed
相对误差(%) Standard error
平均相对误差(%)
Average relative error
5.00
4.85
4.97
5.08
3.0
0.6
1.6
0.7
2.2 反应时间对L-阿拉伯糖反应动力学性质的影响
  从图1可以看出,pH5、120 ℃条件下Maillard反应20 min后L-阿拉伯糖的残留率迅速下降到74.32%。如把相近两点的曲线近似看作直线,0 min、20 min两点间直线的斜率为1.284;20 min、40 min两点间的斜率为0.4345;40 min、60 min两点间斜率为0.1141;60 min、120 min、180 min三点成一条直线,线性方程为y=-0.1103x+70.383,R2=0.9992。斜率可以表征L-阿拉伯糖残留率的下降速率(即反应速率),说明反应初期L-阿拉伯糖与氨基酸的结合反应十分迅速,导致L-阿拉伯糖残留率迅速下降,这一阶段以动力学控制为主;20~40 min L-阿拉伯糖残留率的下降速度减缓,说明L-阿拉伯糖与氨基酸结合速度减缓,这可能与逆向反应的存在有关;40~60 min L-阿拉伯糖残留率下降速度进一步减缓,60~180 min L-阿拉伯糖残留率的下降速率与40~60 min的下降速率相差无几,这说明L-阿拉伯糖的损失速率趋于稳定。L-阿拉伯糖的损失速率可以表征本模型体系Maillard反应的反应速率。在反应条件不变的情况下,随着反应时间的延长糖的损失速率趋于稳定,说明此时反应速率取决于Amadori化合物分解为产物的速率,是一个与反应温度有关的热力学控制过程,反应温度不变,反应速率不变。
  L-阿拉伯糖与氨基酸的反应过程:
  从图2不难看出,L-阿拉伯糖与氨基酸反应初期(0~20 min)溶液的pH下降了0.67,而从20~180 min溶液的pH下降了0.7。说明反应初期pH的下降速度非常快,糖-氨基酸的快速结合使H+大量释放出来;而反应中后期pH下降较慢,应是由于产物中有酸性物质的生成所导致,也说明二者的结合速度减缓。
2.3 反应温度对L-阿拉伯糖反应动力学性质的影响
  
单糖在水溶液中主要以氧环式存在,少量以开链式存在。开链式结构遇到羰基试剂时,发生反应并破坏了此平衡,使氧环式不断向开链式移动[1]。这是一个在较低温度下就能进行的由动力学控制的反应,在本实验中半胱氨酸充当了羰基试剂。
  从图3可以看到从室温(25 ℃)到40 ℃,经Maillard反应后糖的残留率迅速下降至70.4%,说明L-阿拉伯糖与氨基酸的结合在较低温(40 ℃)就可快速进行,根据第一组实验的结果,这个过程应主要是动力学控制的过程而非热力学控制[6]。当反应温度升高时,糖的残留率不但没有下降反而上升,反应温度达到100 ℃时糖的残留率继续上升达76.78%,说明L-阿拉伯糖与氨基酸的结合是可逆反应[7]。从图5的Maillard反应路线可以发现糖的损失受三种反应的影响,主要途径是L-阿拉伯糖与氨基酸基酸结合形成Amadori中间体并进一步分解为复杂产物,次要的两条途径是Amadori中间体再分解为L-阿拉伯糖、氨基酸以及糖自身的分解或聚合。在40~100 ℃之间L-阿拉伯糖与氨基酸结合导致的糖的消耗速度低于Amadori化合物分解形成糖的速度,即Amadori化合物分解为糖和氨基酸是一个吸热反应,在一定温度下(100 ℃以下)随着反应温度的升高Amadori化合物分解成糖和氨基酸的反应速度持续加快,超过了L-阿拉伯糖与氨基酸结合的速度,同时Amadori化合物分解为产物的速率比较小,才能使糖的残留率在40~100 ℃表现为一条缓慢上升的曲线;当反应温度超过120 ℃后,糖的残留率出现第二次下降,较100 ℃时的残留率下降了12.56%,说明此时Amadori中间体分解为产物的速度大大加快,使反应平衡向着糖与氨基酸结合的方向进行。当反应温度为140 ℃时,糖的残留率比120 ℃的下降了36.43%,说明Amadori中间体分解为产物的速率依赖于温度,随着温度的升高表现为非线性的快速上升。
  从图4的曲线可以看出,当反应温度为室温至40 ℃时,产物pH下降达0.52,出现第一次较大变化;当40~100 ℃时,产物pH变化仅0.13;当100~140 ℃时,产物pH下降达0.71,出现第二次较大变化,(其中,当100~120 ℃时,产物下降0.3;当120~140 ℃时,产物下降0.41)。这些结果表明,Maillard反应在较低温度(40 ℃以下)时由于糖和氨基酸的结合使产物pH出现较大下降(即由于二者的结合释放出较多的H
+),在中温阶段(40~100 ℃)产物pH变化不大,在较高温阶段(100~140 ℃)产物pH下降也较大,但下降速率比低温阶段小,这可能是由于高温阶段有较多的酸性物质产生,如酚类、小分子脂肪酸类等。
2.4 初始pH对L-阿拉伯糖反应动力学性质的影响
  
从图6可以看出,L-阿拉伯糖与半胱氨酸在120 ℃、不同初始pH条件下反应1 h后,L-阿拉伯糖的残留率不同。pH3时,残留率为66.59%;pH5时,残留率变化不大,仅比pH3时下降1.37%;pH7时,残留率急速下降,比pH5时下降了36.61%;pH9时,残留率仅为15.1%。这些结果说明,初始pH的升高促使L-阿拉伯糖Maillard反应加速,生成褐色产物的速度加快,这可以从反应产物的颜色变化看出(见表5);同时初始pH的升高也明显改变了产物的风味,中性及弱酸性条件下产物的风味较好。
3 初始pH对产物颜色、风味的影响
Table 3 The effect of initial pH on color and flavor of the final products
初始pH
3
5
7
9
产物颜色
透明,浅黄
透明,黄
透明,黄微红
透明,棕红
风味
尖刺谷香,淡硫味
肉味,硫味
烟熏味,肉味
烟熏味,橡胶臭
2.5 讨论
  
从以上结果可以发现反应时间对Maillard反应的影响远小于反应温度和初始pH,因此在实际的反应型香精的生产中选择合适的反应温度和初始pH既可以达到较高的反应速率得到所需风味的产物又可以节约时间和热能。从动力学角度看,反应温度应以高于100 ℃为宜,反应pH应以中性或碱性为宜,但从产物角度我们发现碱性条件虽然加快了Maillard反应的速度,但主要是促使褐色物质的生成而不是风味物质的产生,因此我们推荐在弱酸性或中性条件下生产反应型香精。
3 结论
L-阿拉伯糖与半胱氨酸的Maillard反应,pH5、120 ℃反应温度条件下,反应初期(20 min内)L-阿拉伯糖与氨基酸结合速度很快迅速,L-阿拉伯糖残留Maillard反应速率取决于二者的结合速度,是一个动力学控制过程;随着反应时间的延长,L-阿拉伯糖残留率的变化速率反应速率趋于稳定,反应速率它主要取决于Amadori化合物分解为产物的速率,是一个热力学控制过程,反应速度受温度和反应时间的共同影响,但反应温度的影响大于反应时间,。反应温度对L-阿拉伯糖Maillard反应速率的影响很大,从40~180 ℃,L-阿拉伯糖糖残留率呈现波浪型120 ℃反应3 h的糖残留率远高于140 ℃反应1 h的,就可以说明这一点,这也说明高温可使Maillard反应加速速率迅速提高。说明在L-阿拉伯糖Maillard反应初期反应是动力学控制的过程,而后期是热力学控制过程,反应速度受温度和反应时间的共同影响。
  初始pH对Maillard反应的影响最大十分明显,酸性和弱酸性条件反应缓慢,中性和碱性条件下反应快速。初始pH对L-阿拉伯糖与半胱氨酸的Maillard反应的影响最大。pH9、120 ℃反应1 h产物中L-阿拉伯糖的残留率仅为pH5、140 ℃反应1 h产物的糖残留率的一半。酸性和弱酸性条件Maillard反应较为缓慢,中性和碱性条件下反应快速,但中性及弱酸性条件下的产物风味最好。
 
参考文献
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[4] Somoza V. Five years of research on health risks and benefits of maillard reaction products: an update[J]. Molecular Nutrition & Food Research. 2005,49(7):663-72
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[6] 汪秋安.高等有机化学[M].北京:化学工业出版社,2004:42
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